藏药新药研发学科组与麦类作物分子育种学科组联合研究黑果枸杞种质资源开发与综合评价并取得阶段进展

　　黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium L.）多年生灌木，有很高的光合效率和较强抗逆性，是我国西北荒漠、盐碱地区一种特有药食兼用的生态经济植物。藏医用它治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症，而维吾尔医生常用于治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等病症。近年来，随着整个生境日趋恶化和人为过度采摘砍伐，野生资源正在大面积的减少，部分地区甚至出现枯竭。此外，前期的调查与研究发现，不同产区的黑果枸杞部分表型性状及有效成分种类和含量差异明显，由于缺乏对其次生代谢物差异、质量标准与控制、功效成分生物合成等多方面的综合研究，导致出现种质创新能力差、质量不稳定、市场秩序混乱、种源混杂等诸多问题。 

　　针对目前黑果枸杞资源的研究现状与存在问题，围绕黑果枸杞种质资源综合评价体系的构建及黑果枸杞品质形成与遗传变异、表型性状、有效成分、地域环境等存在着怎样的相关性开展研究，并取得了阶段性进展。

　　1.对我国西北地区枸杞属植物资源进行野外系统考察，收集了生境、标本、形态特征、生态地理因子、资源分布及储量、市场需求等有关黑果枸杞的第一手资料。同时利用分子标记技术对黑果枸杞（L. ruthenicum）遗传多样性和种群遗传结构进行了初步研究与分析，结果发现，青海柴达木地区黑果枸杞遗传多样性最为丰富；同时探索了表型性状、遗传多样性及与生态地理因子的相关性，为该资源的保护与利用及种质创新提供了科学依据。 

　　2.针对黑果枸杞物质基础研究过程中的分离和表征难题，建立了多种模式下的多维液相色谱分离方法，解决了花色苷异构体、花色苷/非花色苷的高选择性分离问题；同时建立、优化了HPLC-DPPH-DAD在线抗氧化筛选系统，为从黑果枸杞等特色生物资源中分离纯化抗氧化活性成分奠定基础。 

　　3.基于黑果枸杞植物化学成分（如花色苷、多糖、生物碱、脂肪酸等）的提取分离及活性筛选研究，建立了有效成分测定与分析技术平台。同时分析了不同产区及野生和种植的黑果枸杞花色苷、多糖、酚酸、黄酮等成分含量差异以及与生态环境因子的相关性，构建黑果枸杞化学指纹图谱与有效成分定量分析相结合的化学多样性评价体系。此外，同一产区种植和野生的黑果枸杞主要功效成分和营养成分平均含量总体差异不显著，表明人工种植黑果枸杞可能是一种更好并值得推广的方式，在保障种植和野生品质一致的同时也促进了其应用。 

　　4.基于枸杞属植物中的转录组数据，通过组装、拼接、比对等分析发现在黑果枸杞中存在一个调控花色苷合成代谢的MYB转录因子LrAN2，其表达量随果实的发育而增加，而该基因在宁夏枸杞（L. barbarum）中几乎不表达。自然群体中LrAN2的等位变异与黑色果实性状紧密关联，在烟草里过量表达LrAN2，除根部外，其他组织部位均表现出紫黑色。此外，利用转录组和代谢组联合分析，初步发现转基因烟草中185个基因（146上调、39个下调）产生差异表达，其中黄酮类生物合成途径差异最显著。 

　　5.黑果枸杞果实味甜多汁且富含花色苷、多糖、维生素、氨基酸、矿质元素、酚酸及类黄酮等物质，通过优化生产工艺并将胶体磨-高压均质-膜分离技术联合应用，发明了一种黑果枸杞、山楂、柠檬复合饮料的制备方法（已转化），其技术参数易于控制，适应范围广，可用于工业化生产。 

　　上述科研工作得到了国家自然科学基金委（31600262）、青海省科技厅（2018-HZ-805、2019-ZJ-7082、2018-ZJ-T08）、中国科学院“西部之光”等项目的资助。该研究依托中科院藏药研究重点实验室和高原生物适应与进化重点实验室，同时感谢高原生态学研究中心钱大文博士和柯浔博士在生态地理环境数据处理方面给予的帮助。 

　　主要论文与专利信息： 

　　(1) Variation of anthocyanin content in fruits of wild and cultivated Lycium ruthenicum. Industrial Crops and Products (IF=4.191, 农林科学一区), 2020, 146. Doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112208. 第一作者：刘增根，通讯作者：刘宝龙、岳会兰。 

　　(2) Phytochemical profiles, nutritional constituents and antioxidant activity of black wolfberry (Lycium ruthenicum Murr.). Industrial Crops and Products (IF=4.191, 农林科学一区), 2020, 154. Doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112692. 第一作者：刘增根，通讯作者：邵赟。 

　　(3) Ultrasonic extraction of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr. and its antioxidant activity. Food Science & Nutrition (IF=1.747, 农林科学三区), 2020. Doi:10.1002/fsn3.1542. 第一作者：刘增根，通讯作者：刘宝龙、岳会兰。 

　　(4) Functional MYB transcription factor encoding gene AN2 is associated with anthocyanin biosynthesis in Lycium ruthenicum Murray. BMC Plant Biology (IF=3.670, 植物科学二区), 2019, 19:169, Doi.org/10.1186/s12870-019-1752-8. 并列第一作者：宗渊、朱雪冰、刘增根，通讯作者：刘宝龙。 

　　(5) 授权发明专利：一种黑果枸杞、山楂、柠檬复合饮料的制备方法（ZL201510274592.0，已于2019年9月转化），发明人：刘增根、文怀秀、苑祥、史强强、邵赟、梅丽娟、王启兰、陶燕铎。发明专利链接：http://www2.soopat.com/Patent/201510274592?lx=FMSQ 

　　

 

　　图1 黑果枸杞野外调查及采样分布图 ( : East Qaidam Basin of Qinghai, :West Qaidam Basin of Qinghai, : South of Xinjiang, : North of Xinjiang, : Hexi Corridor of Gansu, : West of Inner Mongolia, : Yellow River basin of Ningxia)

　　

 

　　图2 黑果枸杞花色苷分离（a）和HPLC-DPPH-DAD在线抗氧化筛选系统（b）

　　

 

　　图3 野生和种植黑果枸杞成熟果实中主要功效成分比较

　　

 

　　图4 黑果枸杞化学指纹图谱（A、B）及化学计量学分析（C、D）

　　

 

　　图5 黑果枸杞果实不同发育阶段花色苷含量和LrAN2相对表达量变化情况（a-e）、转基因烟草（LrAN2和LbAN2）的表型和花色苷相对含量比较（f-g）